LKB1对宫颈癌细胞转录谱的影响及抑癌机制研究与CIP2A调控宫颈腺癌多药耐药的研究

【摘要】第一部分LKB1对宫颈癌细胞转录谱的影响及抑癌机制研究宫颈癌是全球范围内女性第二大常见恶性肿瘤,每年新发宫颈癌病例大约53万。尽管在发达国家随着筛查方法的改进,宫颈癌的发病率已经降低,但是在发展中国家,由于社会经济因素,宫颈癌的筛查方法不能广泛普及,因此宫颈癌仍然是威胁妇女的主要致死因素。宫颈癌的发生有病毒方面的因素,高危型人乳头瘤病毒(High-risktypehumanpapillomavirus,hr-HPV)感染与宫颈癌的发生密切相关。这一事实提供了预防宫颈癌的方法,即预防接种HPV疫苗阻止感染。尽管HPV疫苗已经上市,但是对于已经感染HPV或者患有免疫抑制的病人没有效果。HPV是一类无包膜的小DNA病毒,可以在表皮和粘膜上皮细胞复制增殖。根据HPV的临床意义,可将其分为高危和低危型。持久的高危型HPV感染是宫颈癌发生的主要致病因子。全球大约70%的宫颈癌由HPV16,18型引起。高危型HPVs的两个癌蛋白E6和E7具有促进细胞增殖的作用,在宫颈癌的恶性转化过程中起重要作用。E6、E7分别与抑癌蛋白p53和pRb相互作用,促进它们的降解诱发肿瘤发生。尽管HPVs在宫颈癌的发生中发挥了重要的作用,但是只有一小部分感染了高危型HPVs的女性最终发展为宫颈癌,而且从最初感染HPVs到最终进展为宫颈癌,这一过程需要几十年的时间,提示高危型HPVs的感染对于宫颈的癌变是必要的但不是充分的条件。此外,有些宫颈癌检测不到HPVs。因此,在宫颈的癌变过程中,一定有一些其它协同因子或遗传事件参与其中。肝激酶B1(liverkinaseB1,LKB1)又称丝氨酸-苏氨酸激酶(serinethreoninekinase,STK11),最初在黑斑息肉综合征(Peutz-Jegherssyndrome,PJS)研究发现,LKB1基因突变是导致PJS发生的因素,PJS患者对胃肠道肿瘤,乳腺肿瘤,妇产肿瘤的易感性增加。继而在散发性肿瘤中,也发现了LKB1基因的体细胞突变,如非小细胞肺癌、结肠癌、乳腺癌和宫颈癌等,因而LKB1已作为一个比较公认的抑癌基因被广泛研究。LKB1抑癌的分子机制目前尚不十分清楚,现有的研究表明,LKB1是一种重要的上游蛋白激酶,LKB1与伪激酶STRAD和清道夫蛋白M025形成功能三聚体,这个复合体可以磷酸化至少14种在T环活化位点具有保守苏氨酸的丝氨酸-苏氨酸激酶,而使之激活。个研究非常多的LKB1底物是AMP-活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK),AMPK是细胞、机体代谢的主要调节剂,LKB1可通过AMPK对外界各种生理病理刺激作出反应,例如：骨骼肌收缩,低氧,饥饿,H202,二甲双胍和苯乙双胍等。重要的是,LKB1通过激活AMPK调节细胞生长和细胞周期,活化的AMPK激活TSC2复合体和nTOR伴侣分子raptor,进而负向调控nTOR信号通路,抑制细胞生长。此外,LKB1参与调控细胞极性,细胞增殖,细胞迁移,细胞衰老,凋亡,DNA损伤反应,细胞分化和有氧糖酵解过程等,也与其抑制肿瘤发生的机制有关。LKB1基因突变在宫颈癌中的研究最早始于1999年,根据不同的文献报道,宫颈癌中LKB1基因突变率在2-20%,但有关宫颈癌组织中LKB1蛋白表达状况的报道尚很少。目前,宫颈癌细胞中LKB1抑制细胞增殖的分子机制研究主要集中于LKB1/AMPK通路。已有文献报道,在宫颈癌细胞HeLa、SiHa中过表达LKB1可以抑制其生长,且依赖于LKB1的激酶活性；LKB1可抑制HeLa细胞的锚定非依赖性生长,但对SiHa细胞没有此作用；应用AMPK激活剂(如AICAR、二甲双胍等)对于具有LKB1/AMPK/mTOR完整信号通路的宫颈癌细胞系有抑制作用。但是,LKB1抑癌分子机制的研究尚存在许多的未知,LKB1是否可调控更多的下游基因?是否有新的通路参与其抑癌作用机制?LKB1在宫颈正常组织及癌组织中的蛋白表达及功能?这些都是尚待解决的问题。深入研究LKB1的抑癌分子机制将有助于发现更多的关键分子,为治疗干预宫颈癌的发生发展提供新的思路和靶标。基于LKB1在宫颈癌发生发展中的潜在重要作用,本研究在宫颈癌细胞中初步研究了LKB1的生物学活性,并对临床宫颈癌组织中LKB1蛋白的表达状况进行了检测。重要的是,我们首次利用基因芯片Microarray技术研究了LKB1对宫颈癌细胞基因转录谱的影响,通过生物信息学对差异表达基因进行了分析,继而在mRNA和蛋白水平给予验证。其中,在磷脂酰肌醇(PI3K)信号通路中,我们发现II型四磷酸肌醇磷酸酶(Inositolpolyphosphate4-phosphatasetypeII,INPP4B)基因的表达在LKB1过表达后明显上调,进一步的细胞学实验进一步证明INPP4B是LKB1重要的下游靶分子。INPP4B也是一种潜在的肿瘤抑制因子,LKB1对INPP4B表达的调控作用尚未见报道。一.LKB1表达对宫颈癌细胞增殖的影响为检测LKB1蛋白表达对宫颈癌细胞增殖的影响,我们将编码LKB1的质粒成功转染了HeLa细胞(LKB1表达缺失)并经历短期G418筛选,Westernblot检测此细胞中有明显的LKB1蛋白表达。进一步采用CCK-8方法检测细胞的增殖活性,结果显示,过表达LKB1的HeLa细胞增殖能力显著低于载体对照组。采用BrdU实验检测了细胞周期改变,结果发现HeLa细胞过表达LKB1后,位于S期的细胞数目显著降低,DNA复制合成减少,表明细胞生长增殖能力下降。以上结果说明LKB1蛋白抑制宫颈癌细胞HeLa的生长增殖。LKB1稳转细胞系HeLa-LKB1的研究结果表明：LKB1蛋白在稳转细胞系中有效表达,而且可检测至p-AMPK磷酸化水平的升高,说明在HeLa-LKB1细胞中LKB1可磷酸化其下游的MPK使其活化,LKB1具有活性,且LKB1-AMPK的信号通路是完整的。二.LKB1蛋白在宫颈癌组织中的表达为探究LKB1蛋白在临床宫颈癌组织中的表达状况,我们对78例宫颈癌(包括25例宫颈腺癌、53例宫颈鳞癌)和25例正常宫颈组织进行了免疫组化检测。结果表明,在44%(11/25)的宫颈腺癌、60.4%(32/53)的宫颈鳞癌组织中LKB1蛋白表达缺失。以上结果说明,宫颈癌组织中LKB1蛋白表达有较高的缺失率,这与公认的LKB1是一个抑癌基因一致。检测结果发现在正常宫颈组织中存在LKB1表达弱阳性或不表达,这与文献中报道的正常结直肠、胰腺组织LKB1的表达情况类似。三.LKBl转录谱的研究以及LKB1的新靶标INPP4B的发现尽管已知LKB1可以调控至少14种下游激酶,但是LKB1的作用机制仍然没有完全清楚,为探究宫颈癌细胞中受LKB1调控的基因,我们进行了Microarray基因芯片水平的转录谱研究。通过Microarray实验,在稳定表达LKB1蛋白的HeLa细胞系中,我们识别了222个LKB1调控的差异表达基因,其中下调的基因有117个,上调的基因有105个。qRT-PCR技术对七个差异表达基因LKB1、PLK2、ABCC2、GLP2R、KYNU、MAL2和AKAP12进行了mRNA水平的验证,结果证实Microarray数据真实反映了基因在转录水平的变化。生物信息学方法进一步分析差异表达基因。基因本体方法(geneontology,GO)对差异表达基因进行了分类,GO数据库分为生物学过程分类,分子功能分类以及细胞组分分类。分析结果显示,222个差异表达基因可归属在40个生物学过程分类,23个分子功能分类以及20个细胞组分分类中。LKB1调控的基因多参与信号转导,蛋白间相互作用以及定位于膜上。KEGG信号通路数据库对差异表达基因的分析发现了8个有统计学意义的生物学通路。其中两条通路是与代谢有关,分别是精氨酸和脯氨酸代谢通路、肌醇磷酸代谢通路,这与LKB1参与代谢的观点一致。另外一条重要的信号通路是磷脂酰肌醇(PI3K)信号通路,有文献报道LKB1-AMPK信号通路可与PI3K-Akt信号通路汇合在mTOR,参与调控细胞的生长与代谢。另外LKB1还参与了轴突发育通路和造血干细胞系分化通路。在PI3K信号通路中的分析中我们发现一个重要的磷酸肌醇磷酸酶INPP4B基因的表达在LKB1过表达后明显上调。采用qRT-PCR进一步证实在过表达LKB1的HeLa中INPP4BmRNA水平显著增加。Westernblot结果表明：LKB1稳转HeLa细胞中INPP4B蛋白水平升高1.4倍,同时在瞬转LKB1且经历G418短期筛选的HeLa细胞中INPP4B蛋白水平升高1.9倍。进一步采用特异性siRNA,在表达LKB1且LKB1-AMPK通路完整的宫颈癌CaSki细胞中敲低LKB1,Westernblot检测INPP4B的表达变化,发现敲低LKB1后,INPP4B蛋白表达水平也随之降低。我们进一步检测了LKB1稳转HeLa细胞系中p-Akt水平改变,结果表明,与空载对照细胞HeLa-vetor相比,HeLa-LKB1细胞中Akt磷酸化水平明显下降。以上结果证明,抑癌蛋白LKB1可正向调控INPP4B的表达,INPP4B是LKB1下游的一个新靶蛋白。在过表达LKB1的HeLa细胞系中INPP4B表达上调,而磷酸化Akt水平下降,提示LKB1通过上调INPP4B参与了PI3K/Akt通路的负向调控,这可能是LKB1抑制细胞增殖的一个新通路。综上所述,本研究探讨了抑癌蛋白LKB1在宫颈癌中的作用；并首次应用Microarray技术对表达LKB1的宫颈癌细胞进行了基因转录谱分析,进一步对发现的新靶标INPP4B进行了初步研究。研究证实,过表达LKB1对宫颈癌细胞生长增殖有抑制作用,在超过50%的宫颈癌组织中LKB1蛋白表达缺失,说明LKB1的抑癌活性在宫颈癌发生发展中具有重要作用。基于Microarray分析我们识别了222个受LKB1调控的基因,发现了8个有统计学意义的生物学通路。在PI3K信号通路中一个重要的抑癌基因INPP4B在LKB1过表达后明显上调,细胞学实验进一步证明INPP4B是LKB1下游的一个新靶标。在过表达LKB1的HeLa细胞系中INPP4B上调,而磷酸化Akt水平下降,提示LKB1通过上调INPP4B参与了P13K/Akt通路的负向调控,这可能是LKB1抑制细胞增殖的一个新通路。以上发现为深入研究LKB1调控的分子信号通路奠定了实验基础,为宫颈癌的治疗干预提供了新的分子靶标。第二部分CIP2A调控宫颈腺癌多药耐药的研究宫颈癌是世界范围内最常见的妇科肿瘤疾病之一,严重威胁女性的身体健康,死亡率位居发展中国家女性肿瘤的第二位。近年来,全球宫颈癌的发病率呈现上升和年轻化的趋势。流行病学研究结果表明,高危型人乳头瘤病毒(Humanpapillomavirus,HPV)感染是妇女宫颈癌和宫颈上皮内瘤变的高危因素。虽然宫颈癌筛查方法的普及和HPV预防性疫苗的出现有效降低了全球宫颈癌的发病率。然而,在发展中国家宫颈癌仍然是影响和威胁女性健康的重要因素。手术和放疗是宫颈癌的主要治疗方法,早期以手术治疗为主,中晚期多采用放射治疗。过去,一直认为宫颈癌属于化疗不敏感的肿瘤,仅在晚期及复发的患者中将化疗作为综合治疗的一部分。近年来,国内外学者对化疗在宫颈癌中的应用进行了大量的基础和临床研究,发现经化疗后患者5年生存率明显提高,因此确立了化疗在宫颈癌治疗中的重要地位。化疗的优势在于可以治疗肿瘤周围肉眼看不见的微小转移灶以及可能存在的全身亚临床转移和复发的病人。近10年来对宫颈癌的综合治疗日益受到关注,综合治疗已成为现代治疗宫颈癌的一个重要策略。然而,尽管人们已经认识到化疗在宫颈癌中的作用,并且已经将化疗作为宫颈癌治疗的重要手段,但是宫颈癌多药耐药的产生却大大限制了化疗药物的疗效和应用,导致治疗失败,肿瘤复发。宫颈癌细胞产生多药耐药的机制分为两大类：①对天然化疗药物的耐药机制,主要包括P糖蛋白的过度表达及DNA拓扑异构酶酶含量与活性的改变；②对铂类化合物和烷化剂耐药的机制,主要包括药物在细胞内积聚减少,巯基化合物(GSH、GST、MT)对药物的解毒力增加,DNA损伤修复能力增加等。P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)是一种跨膜糖蛋白,由多药耐药基因(MDR1)编码。P糖蛋白是ABC转运蛋白家族的一员,通过与抗癌药物结合后再与ATP结合,经ATP供能将细胞内药物逆浓度梯度运出胞外,使细胞内药物浓度不断下降从而使之达不到有效杀伤浓度,最终导致肿瘤细胞耐药性的产生。在使用天然化疗药物后,几乎50%的肿瘤都有P-gp蛋白的表达增加。宫颈癌的耐药问题也与P-gp的表达增加密切相关。Cancerousinhibitorofproteinphosphatase2A(CIP2A)是一种2007年发现的癌蛋白,CIP2A可抑制PP2A对c-Myc62位丝氨酸(S62)的去磷酸化,从而增加细胞中c-Myc的蛋白水平。研究发现,CIP2A在很多人类恶性肿瘤中过表达,例如胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、急性白血病、前列腺癌、宫颈癌等。CIP2A还可以促进细胞的恶性生长增殖,并与化疗药物导致肝细胞癌、乳腺癌、白血病细胞的凋亡有关。那么,CIP2A是否也和宫颈癌的耐药性相关?进而是否参与了宫颈癌多药耐药机制的产生?CIP2A在宫颈癌中与P-gp蛋白的表达有无关联?这些问题是我们此项研究的重点。一.敲低CIP2A提高了宫颈癌细胞对化疗药物的敏感性我们在宫颈腺癌细胞系HeLa中特异性敲除CIP2A后,使用临床常用的三种肿瘤化疗药物多柔比星(Dox)、顺铂(Cis)和紫杉醇(Pac)处理细胞,通过MTT实验观察药物对HeLa细胞的杀伤作用。实验结果显示,多柔比星(Dox)、顺铂(Cis)和紫杉醇(Pac)三种化疗药物抑制HeLa细胞增殖,在特异性敲低CIP2A后,三种化疗药物对HeLa细胞增殖的抑制能力显著增加。这表明,在HeLa细胞中CIP2A与化疗药物疗效有关,敲低CIP2A能够提高HeLa细胞对化疗药物的敏感性,因此本部分实验提示CIP2A可能参与肿瘤的多药耐药(MDR)。二.CIP2A和P-gp蛋白的表达在宫颈癌组织中密切相关我们在山东大学齐鲁医院收集了103例石蜡包埋组织块,其中包括15例正常宫颈组织、16例CINI、17例CINII、12例CINIII、43例宫颈腺癌,利用免疫组化技术检测CIP2A和P-gp的蛋白表达情况。实验结果显示CIP2A和P-gp在15例正常组织、16例CINI、17例CINII组织中均不表达；12例CINIII组织中有1例(8.3%)CIP2A阳性,在43例宫颈腺癌组织中有16例(37.2%)有CIP2A的表达；P-gp在12例CINIII组织中表达阴性,在43例宫颈腺癌组织中有13例(30.2%)有P-gp的表达。CIP2A主要表达于胞浆,而P-gp主要位于细胞膜上。免疫组化结果显示,CIP2A和P-gp的表达在同一个宫颈癌标本上强度一致。并且统计学分析显示在宫颈腺癌组织中,CIP2A和P-gp表达正相关((r2=0.617,p<0.001)),P-gp表达和病人年龄、肿瘤大小、临床分期、肿瘤淋巴结转移、淋巴转移无相关性,但与肿瘤分化成度有关(p=0.029)。以上结果显示,在宫颈腺癌组织标本中,CIP2A和P-gp表达成正相关。三.CIP2A通过调控P-gp蛋白影响宫颈癌的多药耐药为了进一步验证CIP2A与P-gp蛋白之间的关系,我们进行了如下实验：多柔比星(Dox)、顺铂(Cis)和紫杉醇(Pac)三种化疗药物处理HeLa细胞,检测化疗药物作用后CIP2A与P-gp蛋白的表达水平；同时检测抗DoxHeLa细胞系HeLa/Dox中CIP2A与P-gp蛋白的表达水平,同时在该细胞系中特异敲低CIP2A后,检测P-gp蛋白的水平变化；在HeLa、HeLa/Dox细胞系中特异性敲低CIP2A后,罗丹明外排实验检测P-gp蛋白的功能。研究结果显示,化疗药物处理HeLa细胞后,CIP2A与P-gp蛋白的表达水平均明显上升；耐药细胞系HeLa/Dox中CIP2A与P-gp蛋白的表达水平较HeLa细胞显著增高,在干扰CIP2A后,P-gp蛋白的表达水平随之降低；在HeLa、HeLa/Dox细胞系干扰CIP2A后,罗丹明外排实验结果显示细胞内荧光信号显著增强,表明P-gp蛋白的药物外排功能受到抑制。上述结果提示,CIP2A通过P-gp蛋白实现对宫颈腺癌耐药的调控。综上,本研究利用体内外实验首次验证了CIP2A参与宫颈腺癌多药耐药的形成,这种作用主要是CIP2A通过上调P-gp蛋白的表达来实现的。在宫颈腺癌组织中CIP2A和P-gp蛋白的表达呈正相关；敲低CIP2A可提高宫颈腺癌细胞对多种化疗药物的敏感性,P-gp蛋白的表达水平也随之降低。因此,我们的研究结果提示,CIP2A作为一个新的基因治疗靶标,在宫颈腺癌的综合治疗中有着潜在的应用前景。
【作者】张晓丽；
【导师】赵蔚明；陈健行；
【作者基本信息】山东大学，病原生物学，2014，博士
【关键词】宫颈癌；LKB1；Microarray；INPP4B；宫颈腺癌；多药耐药；CIP2A；P糖蛋白(P-glycoprotein；P-gp)；

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